蛋白層析柱一般用于純化蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是各種大分子物質(zhì)之間理化特性的差異性。親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時應(yīng)注意選擇適當?shù)臈l件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強度、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。

 

　　生物大分子和配體之間達到平衡的速度很慢，所以樣品液的濃度不易過高，上樣時流速應(yīng)比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時間進行吸附。當配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質(zhì)較多時，可以在上樣后停止流動，讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時間，或者將上樣后流出液進行二次上樣，以增加吸附量。

 

　　樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強度，以減小基質(zhì)、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。

 

　　層析柱的柱效測定是在純化實驗中非常重要的步驟，也是我們得到準確結(jié)果的保證。如果您是自己裝柱，建議您在使用前先做柱效測定來確定柱子的效果。另外，當層析柱使用過一定次數(shù)，或者發(fā)生實驗結(jié)果異常，柱子進入氣泡，超壓等問題，我們也可以對柱子進行柱效測定來判斷柱效是否正常。

 

　　蛋白層析柱的柱效測定標準：

 

　　柱效測定主要通過計算理論踏板高度（HETP）和對稱性（As）來確定，Pulsetest是目前常用的測試方法，即使用少量的樣品流經(jīng)裝填好的層析柱中，通過儀器上的檢測器檢測實驗過程，實驗結(jié)束后對洗脫峰進行分析。